Monkeypox وائرس حقيقي وقت PCR کٽ
پيداوار جي تفصيل
ارادو استعمال
اهو ريئل ٽائيم پي سي آر سسٽم استعمال ڪندي انساني سيرم يا زخم exudate نموني ۾ Monkeypox وائرس جي سڃاڻپ لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.
ٽيسٽ اصول
هي پراڊڪٽ هڪ فلورسنٽ پروب تي ٻڌل آهي Taqman® حقيقي وقت جي پي سي آر ايس ايس سسٽم.مخصوص پرائمر ۽ پروبس مانڪي پوڪس وائرس جي F3L جين کي ڳولڻ لاءِ ٺهيل آهن.اندروني ڪنٽرول انساني محفوظ ڪيل جين کي نشانو بڻائيندي نموني گڏ ڪرڻ، نموني سنڀالڻ ۽ حقيقي وقت جي پي سي آر جي عمل جي نگراني ڪري ٿو ته جيئن غلط منفي نتيجن کان بچڻ لاء.کٽ هڪ مڪمل طور تي پريمڪس لائوفيلائزڊ سسٽم آهي، جنهن ۾ شامل آهي مواد مانڪي پوڪس وائرس جي سڃاڻپ لاءِ گهربل: نيوڪليڪ ايسڊ ايمپليفڪيشن اينزائم، يو ڊي جي اينزائم، ريڪشن بفر، مخصوص پرائمر ۽ پروب.
مکيه مواد
مهيا ڪيل اجزاء جدول ۾ درج ٿيل آهن.
| اجزاء | پيڪيج | جزو |
| Monkeypox وائرسلائوفيلائز پريمڪس | 8 پٽي پي سي آر ٽيوب× 6 پائوچ | پرائمر، پروبس، dNTP/dUTP Mix، Mg2+، Taq DNA پوليميرس، UDG Enzyme |
| ايم پي وي مثبت ڪنٽرول | 400 μL × 1 ٽيوب | ڊي اين اي جو سلسلو جنهن ۾ ٽارگيٽ جين شامل آهي |
| ايم پي وي منفي ڪنٽرول | 400 μL × 1 ٽيوب | ڊي اين اي جو سلسلو جنهن ۾ انساني جين جو حصو آهي |
| حل ڪرڻ جو حل | 1 ايم ايل × 1 ٽيوب | اسٽيبلائيزر |
| مطابقت جو سرٽيفڪيٽ | 1 ٽڪرو | / |
آپريشن فلو
1. نمونيجمع:نموني جي مطابق جراثيم واري ٽيوب ۾ گڏ ڪيو وڃي
معياري ٽيڪنيڪل وضاحتن سان.
2. ريجنٽ تيار ڪرڻ (ريجينٽ تيار ڪرڻ جو علائقو)
کٽ جي اجزاء کي ٻاهر ڪڍو، انهن کي ڪمري جي حرارت تي توازن رکو، اسٽينڊ بائي استعمال لاء.
3. نموني پروسيسنگ (نموني پروسيسنگ ايريا)
3.1 نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ
اها سفارش ڪئي وئي آهي ته 200μL مائع جا نمونا، مثبت ڪنٽرول ۽ منفي ڪنٽرول نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ لاءِ، لاڳاپيل گهرجن ۽ وائرل ڊي اين اي ڪڍڻ واري ڪِٽس جي طريقيڪار مطابق.
3.2 Lyophilized پائوڊر ٽوڙڻ ۽ ٽيمپليٽ اضافو
Monkeypox Virus Lyophilized premix تيار ڪريو نمونن جي تعداد جي مطابق.ھڪڙي نموني ھڪڙي پي سي آر ٽيوب جي ضرورت آھي جنھن ۾ Lyophilized premix پائوڊر شامل آھن.منفي ڪنٽرول ۽ مثبت ڪنٽرول کي ٻن نموني طور علاج ڪيو وڃي.
(1) هر PCR ٽيوب ۾ 15μL Dissolving سلوشن شامل ڪريو جنهن ۾ Lyophilized premix شامل آهي، پوءِ هر PCR ٽيوب ۾ ترتيب وار 5μL ڪڍيا نمونا/منفي ڪنٽرول/مثبت ڪنٽرول شامل ڪريو.
(2) پي سي آر ٽيوب کي مضبوطيءَ سان ڍڪيو، پي سي آر ٽيوب کي هٿ سان ڇڪيو جيستائين لائو فلائيز پائوڊر مڪمل طور تي ٺهڪي نه وڃي ۽ ملائي، فوري طور تي گهٽ رفتار سينٽرفيوگريشن ذريعي پي سي آر ٽيوب جي تري تائين مائع گڏ ڪريو.
(3) جيڪڏهن معلوم ڪرڻ لاءِ عام ريئل ٽائيم پي سي آر اوزار استعمال ڪريو، پوءِ سڌو سنئون پي سي آر ٽيوب کي ايمپليفڪيشن ايريا ڏانهن منتقل ڪريو؛جيڪڏهن استعمال ڪريو BTK-8 جي سڃاڻپ لاءِ، پوءِ هيٺين عملن کي انجام ڏيڻ جي ضرورت آهي: منتقل ڪريو 10 μL مائع PCR ٽيوب مان BTK-8 جي رد عمل واري چپ کوهه ڏانهن.ھڪڙي پي سي آر ٽيوب چپ تي ھڪڙي کوھ سان ملندڙ آھي.پائپنگ آپريشن دوران، پڪ ڪريو ته پائپٽ 90 درجا عمودي آهي.ايروسول بيئرر پائيپٽ جي ٽوپس کي کوهه جي وچ ۾ وچولي قوت سان رکڻ گهرجي ۽ پائيپٽ کي دٻائڻ بند ڪيو وڃي جڏهن اهو پهرين گيئر تي پهچي (بلبلن کان بچڻ لاءِ).کوهه ڀرجڻ کان پوءِ، سڀني کوهن کي ڍڪڻ لاءِ هڪ ردعمل چپ جھلي ڪڍو ۽ چپ کي پوءِ ايمپليفڪيشن جي سڃاڻپ واري علائقي ڏانهن منتقل ڪيو ويندو.
4. پي سي آر ايمپليفڪيشن (ڊٽيڪشن ايريا)
4.1 PCR ٽيوب/رد عمل چپ کي رد عمل جي ٽانڪي ۾ وجھو ۽ هر رد عمل جا نالا چڱيءَ ريت ترتيب ڏيو.
4.2 فلورسنس جي چڪاس جي سيٽنگون: (1) Monkeypox وائرس (FAM)؛(2) اندروني ڪنٽرول (CY5).
4.3 ھيٺ ڏنل سائيڪلنگ پروٽوڪول کي ھلايو
ABI7500 جو پروٽوڪول، Bio-Rad CFX96، SLAN-96S، QuantStudio:
| قدم | گرمي پد | وقت | سائيڪلون | |
| 1 | اڳواٽ ٺهڻ | 95 ℃ | 2 منٽ | 1 |
| 2 | رد ڪرڻ | 95 ℃ | 10 ايس | 45 |
| annealing، توسيع، fluorescence حصول | 60 ℃ | 30 ايس | ||
BTK-8 جو پروٽوڪول:
| قدم | گرمي پد | وقت | سائيڪلون | |
| 1 | اڳواٽ ٺهڻ | 95 ℃ | 2 منٽ | 1 |
| 2 | رد ڪرڻ | 95 ℃ | 5 ايس | 45 |
| annealing، توسيع، fluorescence حصول | 60 ℃ | 14 ايس | ||
5. نتيجن جو تجزيو (مهرباني ڪري ڏسو اوزار استعمال ڪندڙ مينوئل)
ردعمل کان پوء، نتيجا خودڪار طريقي سان محفوظ ڪيا ويندا.تجزيو ڪرڻ لاءِ "تجزيو" تي ڪلڪ ڪريو، ۽ اوزار خودڪار طريقي سان هر نموني جي Ct قدرن جي نتيجن جي ڪالمن ۾ تفسير ڪندو.منفي ۽ مثبت ڪنٽرول جا نتيجا ھيٺ ڏنل "6. معيار ڪنٽرول" جي مطابق ھجن.
6. معيار تي ضابطو
6.1 ناڪاري ڪنٽرول: FAM چينل ۾ ڪو به Ct يا Ct>40، CY5 چينل ۾ Ct≤40 عام امپليڪشن وکر سان.
6.2 مثبت ڪنٽرول: Ct≤35 FAM چينل ۾ عام ايمپليفڪيشن وکر سان، Ct≤40 CY5 چينل ۾ عام ايمپليفڪيشن وکر سان.
6.3 نتيجو صحيح آهي جيڪڏهن مٿين سڀني معيارن کي پورو ڪيو وڃي.ٻي صورت ۾، نتيجو غلط آهي.
نتيجن جي تشريح
هيٺيان نتيجا ممڪن آهن:
| FAM چينل جي Ct قدر | Ct قدر CY5 چينل | تعبير | |
| 1# | نه Ct يا Ct> 40 | ≤40 | Monkeypox وائرس منفي |
| 2# | ≤40 | ڪي به نتيجا | Monkeypox وائرس مثبت |
| 3# | 40-45 | ≤40 | ٻيهر ٽيسٽ؛جيڪڏهن اهو اڃا تائين 40 ~ 45 آهي، رپورٽ ڪريو 1# |
| 4# | نه Ct يا Ct> 40 | نه Ct يا Ct> 40 | غلط |
نوٽ: جيڪڏهن غلط نتيجو ٿئي ٿي، نموني کي گڏ ڪرڻ ۽ ٻيهر جانچ ڪرڻ جي ضرورت آهي.
آرڊر جي ڄاڻ
| شئ جو نالو | ٻلي.نه | ماپ | نمونو | شيلف زندگي | ٽرانس.۽ اسٽو.عارضي. |
| Monkeypox وائرس حقيقي وقت PCR کٽ | B001P-01 | 48 ٽيسٽ/ڪٽ | سيرم / زخم Exudate | 12 مهينا | -25 ~ 15 ℃ |
